DNA-Analyse in der Tiermedizin - Der genetische Pfotenabdruck

Einleitung

Fast jeder hat schon mal davon gehört, aber fast keiner weiß, was sich genau dahinter verbirgt: der genetische Fingerabdruck. In der Kleintiermedizin noch fast unbekannt, in der Kriminologie nicht mehr wegzudenken. Hunde und Katzen werden vermehrt in gerichtliche Auseinandersetzungen verwickelt, die den Tierarzt direkt oder indirekt betreffen können. Nicht selten wollen Tierhalter beraten werden, welche Schritte sie bezüglich einer Identitätsfeststellung in die Wege leiten können. Da Anwälte hinsichtlich der genetischen Beweisführung bei Haustieren in der Regel unerfahren sind, ist der Tierarzt die erste Anlaufstelle. Dieser Bericht möchte das interessante Thema der Genotypisierung aufgreifen und den interessierten Kollegen einen ersten Einblick geben.

Beispiele aus meiner Praxis

In den meisten Fällen geht es um den Verdacht, ein „falsches“ Tier untergeschoben bekommen zu haben. Der Züchter habe ein „minderwertiges“ Tier mit den falsch angegeben Elterntieren für zuviel Geld verkauft. Diese Fälle gehen seit Verbreitung von Rechtschutzversicherungen bis vor die Gerichte, ohne dass es vorher zu einer gütlichen Einigung kommt. Ein sehr aktueller Fall aus eigenem Hause beschäftigt sich mit der Frage, ob Ovarien nachwachsen können. In diesem Fall wurde eine rollige Katze vorgestellt, die eigentlich schon vor Jahren kastriert wurde. Diese Katze hatte aber dennoch zwei Ovarien, die entfernt wurden. Der Vorwurf ist nun, man habe eine bereits kastrierte Katze nochmals kastriert, oder zumindest hätte man so getan, da sie ja bereits kastriert war. Man kann sich ausmahlen, welche Ausmaße ein solcher Fall annehmen kann. Wenn sich solche Fälle anbahnen, ist es für den betroffenen wichtig, alles genau zu dokumentieren und sogar für die Beweissicherung ein unumstößliches, genetisches Profil zu erstellen.

Die Ursprünge der Diagnostik

Durch die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) im Jahre 1983 durch Kary Mullis und die „Entdeckung“ des genetischen Fingerabdrucks im Jahre 1984 durch Alec Jeffreys konnte genetisches Material so aufbereitet werden, dass es für Identitätsnachweise herangezogen werden konnte. Ein Jahr später wurde der genetische Fingerabdruck erstmals vor Gericht zur Klärung eines Kriminalfalls eingesetzt. Im Jahr 1988 wurde er von deutschen Gerichten als Beweismittel anerkannt. Schon im Jahre 1987 wurde diese Technik für die Anwendung bei Tieren adaptiert (1). und zur Klärung umstrittener Abstammungen in der Hundezucht verwendet (2). Weitere Fortschritte, wie der Einsatz spezifischer DNA-Sonden, führten letztendlich zur Entwicklung der Mikrosatelliten-Analyse, welche später genauer erklärt werden soll.

Tiere vor Gericht

In der Kleintiermedizin handelt es sich meist um Klärung der Abstammung: Ist der Welpe tatsächlich von den angegebenen Elterntieren? Gehört das entnommene Ovar tatsächlich zu der Katze, obwohl diese doch schon vor Jahren kastriert wurde? Dies sind weniger spektakuläre Einsatzmöglichkeiten, die jedoch in den letzten Jahren stark zunehmen. Insofern ist es für den Praktiker von Bedeutung, sich mit den wissenschaftlichen Hintergründen des genetischen Fingerabdruckes vertraut zu machen. Es gibt aber auch spektakuläre Fälle, die dann unter den Begriff der „animal forensics“ fallen.

Animal forensics

Unter animal forensics wird ein Zusammenschluss interdisziplinärer Methoden aus Kriminalbiologie, gerichtlicher Veterinärmedizin, Spurenkunde und Forensik verstanden. Obwohl dieser Fachbegriff auf internationaler Ebene bereits seit über einem Jahrzehnt existiert, steht bisher noch keine adäquate deutsche Bezeichnung zur Verfügung. Im engeren Sinn wird unter animal forensics die Untersuchung tierischen Spurenmaterials verstanden, das im Zusammenhang mit einem Verbrechen als Nachweis einer Verbindung zwischen Täter und Opfer dienen kann. Im weiteren Sinn bezeichnet animal forensics auch die Untersuchung von tierischem Spurenmaterial bei Delikten, in die Tiere direkt als „Tatbeteiligte“ involviert sind. Einige Beispiele sollen das verdeutlichen.

• Im Jahre 1995 wurde erstmals ein Mörder in den USA anhand der molekulargenetischen Analyse von Katzenhaaren überführt. Dieser Kriminalfall dient als Präzedenz für die Möglichkeit, Tatverdächtige anhand des genetischen Profils von Tierhaaren mit Verbrechen in Verbindung zu bringen. Im konkreten Fall wurde bei der Suche nach einer vermissten Frau im Jahre 1994 eine blutbefleckte Lederjacke gefunden. Das menschliche Blut stimmte mit dem Profil der Vermissten überein. Ihr tatverdächtiger Ex-Mann konnte jedoch zunächst nicht mit dem Kleidungsstück in Verbindung gebracht werden. Im Futter der Jacke entdeckte man einige weiße Haare, die als Katzenhaare identifiziert werden konnten. Die DNA, die man aus einer der Haarwurzeln isoliert hatte, diente als Grundlage zur Genotypisierung. Das resultierende genetische Profil wurde mit einem Referenzprofil aus dem Blut von „Snowball“ verglichen, einer weißen Katze, die im Elternhaus des Ehemanns lebte. Es lag 100% Übereinstimmung vor. Die Wahrscheinlichkeit der Existenz einer weiteren Katze mit demselben Profil betrug 1:6,9 x 107. Auf der Basis dieser Beweislage wurde der Ehemann 1997 des Mordes für schuldig befunden (3).
• Im Jahre 1996 wurden zwei Männer und ein Mischlingshund erschossen. Es konnten bei den Tatverdächtigen kein Beweismaterial gefunden werden, was auf die Ermordung der beiden Männer hindeuten könnte. Das Hundeblut der, welches auf der Kleidung der Verdächtigen gefunden wurde, stammte von dem erschossenen Hund. Die Irrtumswahrscheinlichkeit des genetischen Profils des Hundes betrug 1:350 Millionen (4).
• Im Jahre 2002 wurde die siebenjährige Danielle in Sand Diego / USA ermordet. Die Hundehaare, die im Haus des Verdächtigen gefunden wurden, konnten dem Weimaraner der Familie des getöteten Mädchens zugeordnet werden und erwiesen sich als wichtigstes Bindeglied zwischen dem Mörder und dem Tod des Mädchens. Zum ersten Mal wurde hier aufgrund der Analyse von Hunde-DNA ein Mordfall aufgeklärt (5).
• Tiere als Täter
• Eine Frau wurde 2003 in einem öffentlichen Park in IIlinois / USA von zwei Hunden schwer verletzt. Ein weiteres Opfer starb innerhalb weniger Stunden. Ein aggressiver Hund wurde getötet, in seinem Mageninhalt wurde Gewebe des zweiten Opfers gefunden. Daraufhin wurden zahlreiche streunende Hunde eingefangen, darunter auch der Hund, den die Polizei nach der Beschreibung des überlebenden Angriffsopfers für den Täter hielt. Für die öffentliche Sicherheit musste bestätigt werden, dass es sich bei dem Tier um den zweiten Angreifer handelte. Die Kleidung der Opfer wurde auf Hunde-DNA überprüft, diese stimmte mit den Hunden überein.
• Im Jahre 2000 wurde in Oklahoma / USA ein Mann beschuldigt, sein Hund habe eine 74jährige Nachbarin angefallen und schwer verletzt. Die aus Speichelspuren auf der Kleidung des Opfers isolierte Hunde-DNA stimmte mit der des beschuldigten Hundes überein.
• Im März 2000 wurde auf einem Sportgelände in den USA die Leiche eines 7jährigen Jungen entdeckt. Als Todesursache wurden Hundebisse festgestellt. Durch eine STR-Analyse von Speichelresten, Haaren und winzigen Blutspuren der beiden Wachhunde konnten die Hunde des Vaters als Täter identifiziert werden.
• Ein junges Mädchen wurde 2001 Opfer einer schweren Hundebissattacke. Die DNA-Analyse von Blutspuren, die vom Fell eines in Frage kommenden Hundes gesammelt wurden, ergab jedoch keinen Zusammenhang mit der Beißerei. Andere forensische Beweise wie Haare, Fasern und odontologische Untersuchungen konnten ebenfalls kein bestimmtes Individuum mit diesem Fall in Verbindung bringen. Der Hund wurde nicht eingeschläfert.
• Im Fall eines 9jährigen Jungen konnte eine von drei Deutschen Doggen anhand von Speichel auf der Kleidung des Opfers zweifelsfrei als Täter identifiziert werden. Dadurch konnte auf eine Euthanasie der beiden anderen in Frage kommenden Tiere verzichtet werden. 

Grundlagen der Probenennahme

Für den Nachweis der Abstammung muss DNA-Material herangezogen werden. Da die genomische DNA im Zellkern zu finden ist, werden ausschließlich Zellen mit Zellkern benötigt. Blut besteht sich zu ca. 60% aus Zellmaterial. Dieses wiederum besteht zu ca. 99% aus Erythrozyten. Die Erythrozyten haben jedoch, genau wie die Thrombozyten auch, bei der Katze und beim Hund keinen Zellkern und somit keine genomische DNA. Die einzigen für die DNA-Isolierung brauchbaren Zellen sind die Leukozyten. Es werden vom Labor mindestens 0,5 ml EDTA-Blut benötigt. 

Alternativ können auch Abstriche von der Wangenschleimhaut genommen werden. Dabei ist es notwendig, dass vor der Probenentnahme der Patient mindestens 30 Minuten keine Nahrung aufgenommen hat. Die vorherige Aufnahme von Wasser ist unproblematisch. Bei der Probenentnahme sind zur Vermeidung der Probenkontamination Handschuhe zu tragen. Den Tupfer dann einige Zentimeter in die Schutzhülse zurückschieben und ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur trocknen lassen. Erst dann die Probe zum Versand verschließen. Sollte ein direkter Versand nicht möglich sein, kann die Probe bei 5-8°C für kurze Zeit gelagert werden.

Auch Haare können für die Untersuchung eingereicht werden. Die Haare müssen dann mit Wurzel eingeschickt werden. Dazu wird mit Daumen und Zeigefinger ein Haarbüschel umfasst und kurz und kräftig daran gezogen. Es sollten ca. 100 Haare eingeschickt werden. Bei unterschiedlichen Tieren ist eine Kontamination mit Fremdhaaren zwingend zu vermeiden. Wenn Proben von unterschiedlichen Tieren entnommen werden, müssen zwischen den Proben die Hände gewaschen oder die Handschuhe gewechselt werden. Die Haare müssen mit Wurzel eingeschickt werden. Dazu wird mit Daumen und Zeigefinger ein Haarbüschel umfasst und kurz und kräftig daran gezogen. Es sollten ca. 100 Haare eingeschickt werden.

Grundlagen der Genetik

Die DNA setzt sich aus vier chemischen Grundbausteinen zusammen, den Basen Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin, welche über ein Zucker-Phosphatgerüst miteinander verbunden sind und den DNA-Doppelstrang (Doppelhelix) bilden.

 

                             Abb. 1: Aufbau der DNA

Es können sich nur die Basenpaare Adenin (A)-Thymin (T) und Guanin (G)-Cytosin (C) verbinden.

                          Abb. 2: Aufbau der DNA mit Basenverpaarung

Ausgangspunkt der DNA-Typisierung ist das doppelsträngige, fadenförmige DNA-Molekül. Es ist Träger der vollständigen genetischen Information eines Individuums. Durch die spezifische Abfolge der Nukleotide, die so genannte Basensequenz, ist die genetische Information codiert. Die Säugetier-DNA besteht nur aus einem geringen Anteil an Genen. Es handelt sich hierbei um die Bereiche, die die Erbinformation tragen, den so genannten codierten Bereich der DNA, den Exons (expressed region), die nur ca. 5 % der DNA belegen. Der Rest, also ca. 95%, ist nicht codierter Bereich ohne bis jetzt bekannte spezielle Funktion, und wird als Introns (intervening region) bezeichnet. .

                                 Abb. 3: Introns und Exons der DNA

Einige dieser Introns können sich durch bestimmte Einflüsse verändern bzw. mutieren, ohne Folgen für das Erscheinungsbild des Individuums zu haben. Die nicht-codierten Abschnitte sind von Individuum zu Individuum unterschiedlich lang, aber innerhalb eines Individuums liegen keinerlei Längenunterschiede vor, da die DNA in allen Körperzellen gleich ist. Diese nicht-codierten Abschnitte besitzen eine bestimmte Reihenfolge von Basen, die sich mehrmals wiederholen kann. Es gibt hunderte solcher DNA-Abschnitte, die sich nach Längeneinheiten in Minisatelliten und Mikrosatelliten einteilen lassen. Für den genetischen Fingerabdruck werden die Mikrosatelliten herangezogen.

Was sind Mikrosatelliten?

Die Mikrosatelliten, oder auch SSR (Simple Sequence Repeats) genannt, sind kurze, nicht kodierte DNA-Sequenzen. Die wiederholte Sequenz in einem Mikrosatelliten ist sehr einfach und besteht aus zwei bis sechs Basenpaaren, die zwischen 10- und 100-mal wiederholt werden können. Diese Sequenzwiederholungen der Mikrosatelliten variieren zwischen den einzelnen Tieren so stark, dass sich aus der Kombination von zehn bis 14 dieser Mikrosatelliten-Markern ein individuelles, einzigartiges Muster für jedes Tier, ähnlich eines Strichcodes, ergibt.

          Abb. 4: Mikrosatellit mit den Basenpaaren Adenin und Cytosin, die 13x wiederholt werden.

Die ersten Mikrosatelliten-Marker für Katzen wurden Mitte der neunziger Jahre entwickelt. Mittlerweile existieren spezifische Marker für alle Haustiere und zahlreiche Wildtierspezies. Ursprünglich in der Abstammungskontrolle eingesetzt, sind sie zum nützlichen Hilfsmittel für Identitätsnachweise in der Gerichtsmedizin geworden. Diese Analyse setzt das Vorhandensein von DNA voraus, wobei winzige Mengen biologischen Spurenmaterials für eine erfolgreiche Vermehrung der DNA-Abschnitte (Amplifikation) ausreichen. Für Proben mit zersetzter oder fehlender Kern-DNA (altes, autolytisches Gewebe, Haare mit beschädigter oder ohne Haarwurzel) ist diese Methode nicht geeignet.

Der Abstammungsbeweis
Bei der Genotypisierung wird von jedem Tier ein DNA-Profil ("genetischer Fingerabdruck") erzeugt, das so individuell ist, dass man theoretisch ein einzelnes Tier aus 6 Milliarden Tieren identifizieren kann. Bei Abstammungsanalysen wird der genetische Fingerabdruck der Nachkommen mit dem der Eltern abgeglichen. Bei den Nachkommen stammt die eine Hälfte des Erbguts von der Mutter, die andere Hälfte vom Vater ab. Die Mikrosatelliten werden durch beide Elternteile (biparenteral) vererbt. Daher müssen alle Genotypen (Erbbilder) des Nachkommen in den Genotypen der Eltern enthalten sein. Treten bei den Nachkommen Genotypen auf, die bei keinem Elternteil vorkommen, muss die Vater- bzw. Mutterschaft abgestritten werden. Für die Untersuchung wird jeweils ein Primerpaar, (Nukleotid, welches als Stratpunkt für DNA-replizierende Enzyme gilt) an das entsprechende Stück der DNA gelegt und mittels PCR vervielfältigt. Die Primer sind mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, so dass die entstehenden Produkte mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und mittels Größenstandards die genaue Anzahl der Einheiten bestimmt werden kann. Durch die Kombination verschiedener Marker auf den unterschiedlichen Chromosomen ergibt sich für jedes Individuum ein einzigartiges, charakteristisches Bild - der so genannte „genetische Fingerabdruck". Je mehr Marker analysiert werden, umso größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass nur ein einziges Lebewesen diese Konstellation besitzt. Da das Genom eines jeden Tieres durch die Kombination der Genome der Elterntiere zustande gekommen ist, müssen die DNA-Profile aus der Längenanalyse der Mikrosatellitenmarker auch eine Kombination aus den DNA-Profilen der Eltern darstellen. Dadurch kann ein sicherer Abstammungsnachweis geführt werden.

Problem der Identifikation 

Nehmen wir das Beispiel vom Anfang. Sie als Tierarzt haben eine bereits vor Jahren kastrierte Katze erneut kastriert und beide Ovarien entnommen. Jetzt wissen Sie und Ihre Angestellten, die den Vorgang beobachtet haben, dass sie den Eingriff korrekt vorgenommen haben. Der damalige Tierarzt, der Verkäufer der Katze und deren Rechtsanwalt behauptet natürlich das Gegenteil. Es wissen natürlich alle Beteiligten, dass man eine Katze nicht zweimal kastrieren kann. Es sei denn, die Ovarien wären nachgewachsen, was wir aber erstmal außen vor lassen wollen. Gehen wir davon aus, dass die Tierärzte, sowohl Sie als auch der damalige Kollege, die Kastration ordnungsgemäß durchgeführt haben. Dann wurden die Katzen irgendwo vertauscht. Wie können Sie nun beweisen, dass Sie die Ihnen vorgestellte Katze kastriert haben und auch deren Ovarien tatsächlich entfernt haben? Und dass Sie nicht ein Ovariensammellager haben, auf das Sie beliebig zurückgreifen können, wenn Sie mal gerade keine in der Katze finden? Unterschwellig wird Ihnen unterstellt, sie haben nur so getan…..“schnell verdientes Geld“. Wenn die Katze keine Identifikation, Transponder oder Tätowierung) aufweist, sollten Sie dies während der Kastration vornehmen. Dann schicken Sie ein Ovar zum Histologen (in Formalin eingelegt) und ein Ovar zur genetischen Analyse (in isotonischer Kochsalzlösung eingelegt). Sie entnehmen der Katze Blut, die nun eindeutig mit der Transpondernummer zu identifizieren ist. Sie können auch Haare oder einen Backenabstrich für den genetischen Fingerabdruck entnehmen. Die Kosten trägt natürlich die Tierhalterin, falls Sie das nicht möchte wurde Sie zumindest unter Zeugen oder auch schriftlich über die o. g. Möglichkeiten aufgeklärt. Sie haben folgendes erreicht:

• Sie haben eine Katze kastriert, die anhand einer Nummer identifizierbar ist.
• Sie haben nachweislich zwei Ovarien entnommen und eingeschickt.
• Es wird festgestellt, dass es Ovarien sind.
• Es wird festgestellt, dass die Ovarien der von Ihnen angegeben Katze gehörten.

Was Sie nicht festgestellt haben ist:

• Ist das die Katze, die tatsächlich damals bereits von dem Kollegen kastriert wurde?
• Wurde Ihnen bewusst eine falsche Katze von der aktuellen Katzenhalterin vorgestellt?
• Hat die Züchterin damals die Katzen vertauscht?

Aber: Das kann Ihnen dann ganz egal sein!

Ausblick

Die Genotypisierung wird sich in den nächsten Jahren voraussichtlich insbesondere unter Katzenzüchtern herumsprechen. Auch hinsichtlich der Doppelbelegung einer Zuchtkätzin durch mehrere Zuchtkater ist ein genetischer Fingerabdruck interessant.

Aus eigenen Erfahrungen geht bei vielen Rassekatzen-Liebhabern der Trend weg von der günstigen Rassekatze, hin zur gekennzeichneten, FeLV-, FIV-, coronavirus-, giardien- und endoparasitenfreien Katze, die auch hinsichtlich ihrer Gendefekte untersucht worden ist. Wer als Züchter einen genetischen Fingerabdruck seiner Zuchtkatzen vorweisen kann, zeigt deutlich, dass ihm die Transparenz seiner Zucht wichtig ist. Ob es in Zukunft einen Zuchtverband geben wird, der die o. g. Forderungen durchsetzen möchte ist fraglich. Wünschenswert wäre es allemal.

 

Autor: Dr. med. vet. Michael Streicher

Fischbachstraße 10 a, 61440 Oberursel

www.katzen-praxis.de

Norwegische Waldkatzen aus Oberursel